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牛津大学揭示流感病毒基因复制的重要机制和电镜结构

发布时间:2019/09/18 点击量:

2019年9月5日,牛津大学的Ervin Fodor和Jonathan M. Grimes研究组合作(共同一作为范海天博士,Alexander P. Walker,Loïc Carrique博士和Jeremy R. Keown博士)在Nature杂志上发表了题为Structures of influenza A virus RNA polymerase offer insight into viral genome replication的文章,首次报导了完整的A型人流感(H3N2亚型)和禽流感(H5N1亚型)病毒RNAcc国际下载聚合酶的高分辨率晶体和电镜结构。


牛津大学揭示流感病毒基因复制的重要机制和电镜结构


该研究揭示这两种聚合酶有着高度类似的三维结构,它们会形成相似的二聚体(图1)。针对二聚体结合面的关键氨基酸残基的突变会抑制病毒基因的复制,并且是特异性地抑制vRNA的合成。这些结果表明流感病毒RNA聚合酶的二聚体结构是病毒基因复制所不可缺少的。Ervin Fodor课题组此前曾经报导流感病毒的基因复制需要通过一个游离的聚合酶来激活。作者推测游离的聚合酶就是通过与包装在RNP里的聚合酶形成这种二聚体,从而激活病毒基因的复制起始。


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图1:二聚体形式的人流感病毒(H3N2亚型)和禽流感病毒(H5N1亚型)RNA聚合酶的三维晶体结构


此外,作者还针对流感病毒RNA聚合酶构建了一系列纳米抗体(Nanobody)。其中一种纳米抗体可以在溶液中有效抑制聚合酶二聚体的形成。经过晶体和电镜结构验证,这种纳米抗体的结合位点正处于二聚体结合面附近(图2)。进一步的功能实验证实这一纳米抗体能够特异性的抑制vRNA的合成。而另一种对二聚体形成没有影响的纳米抗体则对病毒基因的复制没有任何抑制作用。


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图2:流感病毒聚合酶和纳米抗体(Nanobody)复合物的晶体及电镜结构


为什么聚合酶二聚体只影响vRNA的合成?作者在文中也通过对结构的分析阐明了原因。原来,流感病毒基因复制过程中的两个步骤不是完全一样的。cRNA的合成过程属于从头合成(terminal initiation),也就是从vRNA的起始端开始复制。不同的是,合成的cRNA由于在起始端有一截突出部分,导致在vRNA的合成过程中,复制起始于cRNA的内部(internal initiation)。合成初始两个碱基后,聚合酶会通过一个叫做“重对齐”(realignment)的过程,将cRNA模板拉回一段距离,从而使cRNA的末端与新合成的两个碱基对齐,进而继续合成完整的vRNA。文中通过对聚合酶单体和二聚体电镜结构的比较分析,发现二聚体的形成会使得聚合酶一些柔性结构域的构象发生变化(图3),而这种构象的变化导致了cRNA的结合位点发生位移,而这种位移能够带动cRNA模板移动,从而完成“重对齐”的过程,vRNA的合成也得以继续。


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图3:流感病毒聚合酶单体和二聚体转换过程中RNA结合部位的构象变化


综上所述,文中的研究结果首次展示了致病性A型流感病毒RNA聚合酶的高分辨率三维结构。通过与功能实验相结合,揭示了流感病毒基因复制的重要机制(图4)。同时在对聚合酶的结构研究中确定的二聚体结合面以及与纳米抗体的结合面可以作为理想的抗病毒药物靶点。


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图4:流感病毒聚合酶的转录及复制工作模型


研究背景


流感病毒是危害公众健康的重要病原之一。目前已知的流感病毒有A,B,C,D四种类型。其中A型病毒具有最强的病原性,它不仅会引发季节性流感,变异的A型病毒毒株还会经由动物传染给人类,导致大规模流行病的爆发。流感病毒感染细胞后会复制出许多同样的病毒颗粒。这一过程不断重复,产生大量病毒,从而造成疾病的蔓延和传播。


流感病毒RNA聚合酶(FluPol)是病毒复制的核心部件,它由三个大小类似的亚基,分别为PB1,PB2,PA(P3)构成,每个亚基又由数目不等的结构域组成。在病毒颗粒里,聚合酶包装在核糖核酸蛋白复合物(RNP)中,同时病毒的遗传物质也储存在这一复合物中。在病毒的扩增过程中聚合酶主要行使基因转录和复制两种功能。在病毒基因的转录(Transcription)中,病毒RNA聚合酶与宿主RNA聚合酶(Pol II)相互作用,之后掠取一段宿主信使RNA(mRNA)的帽子结构(5’cap)作为合成病毒基因mRNA的引物。病毒基因的复制(Replication)则不需要任何引物的参与,聚合酶首先利用病毒自身的负链RNA(vRNA)作为模板复制出正链RNA(cRNA)中间物,再由此中间物作为模板复制出更多的vRNA。


流感病毒RNA聚合酶是一个非常理想的抗病毒药物靶点。为了针对性的设计抗病毒药物,就要了解聚合酶的三维结构,尤其要了解其在行使不同功能时的构象变化。近五年,对于流感病毒RNA聚合酶的结构生物学研究取得了突破性的进展。2014年法国EMBL实验室的Stephen Cusack课题组报导了蝙蝠流感以及B型人流感病毒RNA聚合酶的三维晶体结构。Cusack课题组此后还报导了这两种聚合酶同宿主RNA聚合酶Pol II相互作用的相关复合体结构,以及聚合酶在转录过程中的一系列不同构象的结构。2015年英国牛津大学的Ervin Fodor和Jonathan M. Grimes课题组合作报导了C型人流感病毒RNA聚合酶的三维晶体结构,之后他们报导了这一聚合酶同宿主RNA聚合酶Pol II的相关复合物结构。


我国学者在对流感病毒RNA聚合酶的结构的研究中也取得了辉煌的成绩:2015年中科院生物物理所的刘迎芳和清华大学的王宏伟课题组合作报导了A型禽流感病毒的RNA聚合酶大部分成分的4.3埃分辨率的电镜结构,这也是刘迎芳教授在继研究PA亚基取得突破性进展之后的又一重大成果。2019年中科院微生物所的施一和高福课题组首次报导了D型流感病毒RNA聚合酶的一系列不同构象的电镜结构(详见BioArt报道:Nat Micro | 施一/高福团队在流感病毒聚合酶调控RNA合成机制研究领域取得重要进展)。这些结构生物学的研究有力地推动了对流感病毒基因转录机制的认知以及抗病毒药物的开发。然而,时至今日,具有强致病性的A型流感病毒,尤其是人流感和禽流感病毒聚合酶的完整结构仍然未知,同时对于流感病毒基因复制的认识还很匮乏。